No category

منابع پایان نامه ارشد با موضوع دی اکسید کربن، کیفیت محیط، تغییر رنگ

که محیط در شرایط استریل تهیه می شود، این دما فقط برای منعقد کردن محیط استفاده می شود نه برای استریل سازی. حرارت بیش از حد (دو یا سه بار) اثر نامطلوبی بر کیفیت محیط دارد.

شکل ۳- ۱۵ منعقد نمودن محیط ها در دستگاه Coagulator

۳-۸ انجام کشت نمونه ی مایع پلور
به منظور انجام کشت مستقیم نیز حدود ۲/۰ تا ۴/۰ میلی لیتر (۲ تا ۴ قطره) از رسوب سانتریفوژ شده با استفاده از فیلر و پی پت پاستور شیشه ای استریل مستقیماً به سطح محیط کشت لوون اشتاین جنسن منتقل شد. جهت انجام کشت هموژن، ۲ تا ۴ قطره از محلول دکانتامینه شده، به محیط کشت لوون اشتاین جنسن تلقیح گشت. هنگام کشت هموژن باسیل سل، ۲ جنبه حائز اهمیت است؛ اول آنکه نمونه ها باید خوب هموژن شوند تا باسیل را از موکوس، سلول ها و بافت هایی که به آن چسبیده آزاد کند، در ثانی هموژن کردن و دکانتامیناسیون نباید حیات مایکوباکتریوم را از بین ببرد. محیط های تلقیح شده سپس در تاریکی در انکوباتور ۳۷ درجه ی سانتی گراد و در مجاورت ۱۰-۵ % دی اکسید کربن و میزان رطوبت بالا به مدت ۴ تا ۱۲ هفته انکوبه شدند (شکل ۳-۱۰). همینطور که مایکوباکتریوم های عامل سل به آهستگی رشد می کنند، کلنی ها با چشمان غیر مسلح پس از حداقل ۳ هفته قابل مشاهده خواهند بود.
محیط کشت های درون لوله بایستی در وضعیت خوابیده با درهای نیمه بسته قرار بگیرند تا مایع اضافی آنها تبخیر شده و دی اکسید کربن به محیط وارد شود (شکل ۳-۱۶).

شکل ۳- ۱۶ قرار گرفتن محیط های کشت به صورت مورب در انکوباتور ۳۷ درجه ی سانتی گراد

در تمامی مراحل انجام کشت و اسمیر، ضایعات و وسائل مصرفی در محلول ضد عفونی کننده ( فنل ۵% ) اوت شده و در پایان کار نیز در ظرف های مخصوص جهت اتوکلاو فرستاده شدند. محیط کشت ها نیز در صورت منفی بودن، پس از استریل شدن دور انداخته می شوند (شکل ۳-۱۷).

شکل ۳- ۱۷ ظروف مخصوص اتوکلاو حاوی ضایعات و وسائل مصرفی آلوده ی بخش مایکوباکتریولوژی

شکل ۳- ۱۸ فلوچارت مراحل تهیه ی اسمیر و کشت از نمونه ی مایع پلور
۳-۹ بررسی و جوابدهی نتیجه ی کشت
۳-۹-۱ جدول زمانی بررسی کشت
تمامی کشت ها پس از ۷۲ ساعت از نظر جذب نمونه ی تلقیح شده و تبخیر آن کنترل شدند و سپس درب آنها محکم بسته شد تا از خشک شدن محیط و آلوده شدن آن جلوگیری شود، پس از آن کشت ها هر هفته بررسی شدند. پس از یک هفته به منظور بررسی مایکوباکتریوم های سریع الرشد و به مدت ۸ هفته به منظور بررسی رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تحت کنترل قرار گرفتند. بیشتر مایکوباکتریوم ها در عرض ۳ تا ۶ هفته تشکیل کلونی می دهند و تعداد کمی پس از ۷ تا ۸ هفته جدا می شوند.

۳-۹-۲ بررسی منظره ی ماکروسکوپی کشت
وقتی رشد در محیط کشت صورت گرفت، کلونی های بزرگ، گرد، نخودی رنگ، گل کلمی شکل با چشمان غیر مسلح بر روی سطح محیط کشت قابل مشاهده است. این کلونی ها دارای سطح خشک و خشن بوده و بسته به تعداد باسیل ها در نمونه به صورت به مجزا و یا با هم دیده می شوند (شکل ۳-۱۹).

شکل ۳- ۱۹ تصویر کلونی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در محیط لوون اشتاین جنسن

۳-۹-۳ خواندن کشت و ثبت نتایج
تعداد کلونی های ظاهر شده در محیط های کشت در ارتباط مستقیم با تعداد باکتری ها در ضایعات است. این موضوع نشان دهنده ی اهمیت شمارش کلونی هاست و نتایج به صورت تعداد کلونی ها در محیط گزارش می شود. همانطور که گفته شد، کلونی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس خشن، مومی، فاقد رنگدانه (کرم رنگ) و کند رشد است، که ۸-۴ هفته پس از تلقیح ظاهر می شوند (جدول ۳-۳). در موارد مشکوک که اسمیر منفی و کشت مثبت باشد باید گسترش تهیه گردد و به روش زیل نلسن رنگ آمیزی گردد که در مطالعه ی حاضر در ۲ مورد از نمونه ها چنین مراتبی طی شد. پس از ۸ هفته از زمان کشت، کشت های منفی گزارش شدند و محیط ها حذف گشتند.

جدول ۳- ۳ چگونگی خواندن و گزارش نتایج کشت
ظاهر محیط کشت
نحوه ی گزارش
عدم رشد
منفی
کمتر از ۵۰ کلنی
گزارش تعداد کلنی
۱۰۰-۵۰ کلنی
+
۲۰۰-۱۰۰ کلنی
++
۵۰۰-۲۰۰ کلنی
+++
بیش از ۵۰۰ کلنی
++++
آلوده
آلوده

۳-۱۰ اندازه گیری غلظت اینترفرون گاما در نمونه ی پلور بیماران
با توجه به مطالبی که در فصل کلیات درباره ی اینترفرون گاما بیان شد، پس از تهیه ی لام و انجام رنگ آمیزی زیل نلسن و نیز انجام کشت به عنوان روش استاندارد طلائی، اقدام به اندازه گیری سطح اینترفرون گاما در نمونه های مورد نظر کردیم تا با بررسی های انجام شده بتوانیم به طور قطع حضور یا عدم حضور چشمگیر این سایتوکین را در افراد بیمار تشخیص دهیم تا بر این اساس، نقش این سایتوکین بر کارائی و قابلیت پاسخ های ایمنی در برابر عفونت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به عنوان عامل تشخیصی، شناسایی گردد.
در مطالعه ی حاضر به منظور تعیین غلظت اینترفرون گاما از کیت Bioassay Technology Laboratory ساخت کشور چین و Catalog Number : E0105Hu استفاده شد (شکل ۳-۲۰). محدوده ی غلظت قابل سنجش ۱-۴۰۰ نانوگرم بر میلی لیتر و حساسیت تجزیه و تحلیل ۴۹/۰ نانوگرم بر میلی لیتر بود. اساس سنجش غلظت در این کیت بر پایه ی روش الایزا (ELISA) استوار است که در فصل کلیات به آن پرداخته شد.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد درموردجریان های نقدی، وجوه نقد، سود تقسیمی، سود حسابداری

۳-۱۰-۱ اجزای موجود در کیت الایزا

جدول ۳- ۴ اجزای موجود در کیت الیزا (Bioassay Technology Laboratory, China, Catalog number: E0105Hu)
۶ml
A محلول کروموژن
۷
۵/۰ml
۴۸۰) ng/ml محلول استاندارد ۳۶ (
۱
۶ml
B محلول کروموژن
۸
ml3
رقیق کننده ی استاندارد ۳۷
۲
۶ml
محلول متوقف کننده ی واکنش ۳۸
۹
۱۲ چاهک در
۸ ردیف
پلیت الایزای کوت شده ۳۹
۳
۱
بروشور دستورالعمل کیت
۱۰
۶ ml
HRP – استرپتاویدین ۴۰
۴

۲۰ml
محلول شستشوی غلیظ (۳۰×) ۴۱
۵

۱ml
آنتی بادی ضد اینترفرون گاما نشاندار شده با بیوتین
۶

شکل ۳- ۲۰ کیت الیزا برای سنجش اینترفرون گامای انسانی (Bioassay Technology Laboratory, China, Catalog number: E0105Hu)

۳-۱۰-۲ نمونه های مناسب جهت بررسی
نمونه هایی که حاوی NaN3 هستند، نباید تست شوند؛ چراکه این ماده از فعالیت HRP جلوگیری می کند. بعد از جمع آوری نمونه، آزمایش باید تا جائی که ممکن است بلافاصله انجام شود، در غیر این صورت نمونه ها در دمای ۲۰- درجه ی سانتی گراد نگهداری می شدند. ضمناً دقت لازم به عمل آمد تا از یخ زدگی و آب شدن های پی در پی حتی الامکان جلوگیری شود.

۳-۱۰-۳ رقیق سازی محلول استاندارد
این کیت حاوی یک استاندارد از غلظت اصلی را داراست که می توان آن را در لوله های کوچک طبق جدول زیر رقیق سازی نمود. به این صورت که در لوله ی اول ۱۲۰ میکرولیتر از محلول استاندارد اولیه و ۱۲۰ میکرولیتر از رقیق کننده ی استاندارد اضافه می شود تا غلظت ng/ml 240 به دست آید. سپس از لوله ی اول به لوله ی دوم این عملیات تکرار می شود و بدین ترتیب در نهایت ۵ غلظت از استاندارد در اختیار قرار می گیرد (جدول ۳-۵ و شکل ۳-۲۱).

جدول ۳- ۵ دستور العمل ساخت محلول های استاندارد کیت الایزا
روش تهیه

غلظت استاندارد
µl120 استاندارد اولیه + µl120 رقیق کننده ی استاندارد
استاندارد شماره ی ۵
ng/ml 240
µl120 استاندارد ۵ + µl120 رقیق کننده ی استاندارد
استاندارد شماره ی ۴
ng/ml 120
µl120 استاندارد ۴ + µl120 رقیق کننده ی استاندارد
استاندارد شماره ی ۳
ng/ml 60
µl120 استاندارد ۳ + µl120 رقیق کننده ی استاندارد
استاندارد شماره ی ۲
ng/ml 30
µl120 استاندارد ۲ + µl120 رقیق کننده ی استاندارد
استاندارد شماره ی ۱
ng/ml 15

شکل ۳- ۲۱ رقیق سازی محلول استاندارد
۳-۱۰-۴ روش کار-تلقیح نمونه
نمونه ی مایع پلور پس از جمع آوری به مدت ۱۵ دقیقه در دور ۳۵۰۰ سانتریفوژ شد و مایع روئی برای بررسی جداسازی گردید (شکل ۳-۲۲).

شکل ۳- ۲۲ جداسازی نمونه های مایع پلور در میکروتیوب های استریل جهت انجام بررسی مارکرهای بیوشیمیایی (آدنوزین دآمیناز و اینترفرون گاما)

تعداد استریپ های مورد نیاز در این طرح تحقیقاتی شامل تعداد نمونه ها (۴۵ نمونه) بعلاوه ی تعداد استانداردها (۵ استاندارد) و یک چاهک بلانک برای اطمینان از خوانش صحیح دستگاه می باشد (در مجموع ۵۱ چاهک).

۳-۱۰-۵ اساس تست
همانطور که گفته شد اساس تست سنجش غلظت اینترفرون گاما الایزاست. در طی این تست، در صورتی که اینترفرون گاما در نمونه وجود داشته باشد، به آنتی بادی مونوکلونال ضد اینترفرون گاما که به کف پلیت چسبیده است، متصل می گردد. سپس با اضافه شدن آنتی بادی پلی کلونال ضد اینترفرون گاما که با بیوتین نشاندار شده است، این آنتی بادی، اینترفرون گاما را شناسایی کرده و متصل می شوند.
آویدین پروتئین بزرگی است که ۴ چایگاه اتصال برای بیوتین در ساختارش وجود دارد. استرپتاویدین نوعی آویدین است که از استرپتوکوک به دست آمده است. در مرحله ی بعد زمانی که کونژوگه ی آنزیمی (استرپتاویدین-HRP) اضافه شود، بیوتین به استرپتاویدین متصل شده و کمپلکس ایمنی شکل می گیرد. انکوباسیون در این مرحله زمانی را فراهم می سازد که این واکنش ها انجام پذیرند. شستشوی چاهک ها با بافر فسفات سالین آنتی بادی های اتصال نیافته را حذف می کند. پس از آن، اضافه کردن محلول های سوبسترا و کروموژن که به ترتیب شامل پراکسید هیدروژن و تترامتیل بنزیدین (TMB) می باشند، باعث تولید رنگ می شود. به این صورت که پراکسید هیدروژن به عنوان سوبسترای آنزیم HRP، با عمل این آنزیم ایجاد رادیکال اکسیژن آزاد می نماید. این رادیکال آزاد اکسیژن به ساختار TMB حمله کرده و باعث تغییر شکل آن می گردد و در نتیجه رنگ محلول از بی رنگ به آبی تغییر می کند. در مرحله ی بعد اضافه کردن اسید به عنوان متوقف کننده ی واکنش سبب اسیدی شدن محیط و در نتیجه تغییر رنگ TMB از آبی به زرد خواهد شد. غلظت رنگ ایجاد شده در نهایت توسط دستگاه خوانشگر الایزا بر پایه ی فوتومتری قرائت گردید (شکل ۳-۲۳).

شکل ۳- ۲۳ اساس تست الایزای ساندویچ برای ردیابی اینترفرون گاما

۳-۱۰-۶ مراحل انجام تست
۳-۱۰-۶-۱ چاهک بلانک
به چاهک بلانک، نمونه اضافه نمی شود؛ به دلیل اینکه این چاهک حاوی همه ی محلول های طول واکنش می باشد به جز فاکتوری که قرار است اندازه گیری شود (اینترفرون گاما). آنتی بادی ضد اینترفرون گاما، استرپتاویدین کونژوگه با آنزیم HRP، محلول کروموژن A و B و محلول متوقف کننده ی واکنش، مانند چاهک های دیگر به آن اضافه گردید. از آنجائی که اینترفرون گاما در چاهک بلانک وجود ندارد، غلظت رنگ ایجاد شده و نیز جذب نوری این چاهک باید توسط دستگاه، صفر خوانده شود.

۳-۱۰-۶-۲ چاهک های

دیدگاهتان را بنویسید