No category

منابع پایان نامه ارشد با موضوع مورفولوژی

گردید. به این صورت که ۱ قطره از نمونه را بر روی لام تمیز گذاشته و با استفاده از اپلیکاتور چوبی دو نیم شده یا سواب شکسته شده (عدم استفاده از سواب پنبه دار) به خوبی گسترشی منظم و یکسان به ابعاد حداقل ۲×۵/۱ سانتی متر و حداکثر ۳×۲ سانتی متر تهیه می کنیم؛ به صورتی که گسترش نه ضخیم و نه خیلی نازک باشد و بتوان از زیر آن نوشته ای را خواند. پس از تهیه ی گسترش باید حداقل ۳۰ دقیقه زمان داد تا لام کاملاً خشک شود. گسترش های خشک شده با قرار گرفتن در انکوباتور ( دمای ۷۵ – ۶۵ درجه ی سانتی گراد به مدت ۴۵ تا ۶۰ دقیقه ) فیکس شدند. همچنین می نوان برای این کار از چراغ الکلی نیز استفاده نمود. به این صورت که گسترش ۳ بار روی شعله و به فواصل مناسب به نحوی که لام پشت دست را نسوزاند با استفاده از پنس عبور داده می شوند. سپس لام در رک رنگ آمیزی قرار می گیرد تا کمی خنک شود. لام اکنون آماده ی رنگ آمیزی است.
نمونه ها پس از انجام دکانتامیناسیون و خنثی سازی سپس برای تهیه ی گسترش هموژن، طبق آنچه در بالا گفته شد مورد استفاده قرار گرفتند. بدین ترتیب که ۱ قطره از آن بر روی لام تمیز و نو گذاشته شده و پس از خشک شدن فیکس گردید و آماده ی رنگ آمیزی شد.

۳-۵ رنگ آمیزی
مهمترین رنگ آمیزی جهت باسیل سل رنگ آمیزی زیل نلسن است که در مطالعه ی حاضر نیز از همین متد برای رنگ آمیزی لام ها استفاده گردید.

۳-۵-۱ رنگ امیزی زیل نلسن ۳۳
۳-۵-۱-۱ ساخت رنگ فوشین
به منظور ساخت ۱ لیتر محلول فوشین % ۳/۰ ، ۳ گرم فوشین بازی در ۱۰۰ میلی لیتر اتانول حل شد. از طرف دیگر برای ساخت محلول فنل، ۴۵ گرم فنل ابتدا کمی گرم شده تا ذوب گشت و در ۹۰۰ سی سی آب مقطر اضافه گردید و سپس این ۲ محلول توسط یک مگنت مغناطیسی مخلوط شدند. علت اضافه شدن فنل به محلول فوشین این است که اولاً فنل برای باکتری خاصیت کشندگی دارد و در ثانی خاصیت حلقوی فنل برای باز کردن منافذ دیواره ی سلولی مایکوباکتری کمک کننده است. نکته ی حائز اهمیت این است که فوشین خیلی زود کریستالیزه می شود و بنابراین باید به صورت تازه استفاده شود.
لام های تهیه شده پس از فیکس شدن، به ترتیب بر روی پایه ی فلزی چیده شدند به طوریکه با یکدیگر تماس نداشته باشند. محلول فوشین ساخته شده پس از عبور از کاغذ صافی بر روی لام ریخته شد، به طوری که تمامی سطح لام را پوشانده باشد. نفوذ رنگ به داخل باکتری به حرارت متناوب نیاز دارد؛ چراکه حرارت به عنوان یک عامل محیطی باعث می شود دیواره ی سلول باکتری باز شده و رنگ وارد باکتری گردد. بنابر گفته های فوق با استفاده از پنبه الکلی که شعله ور است، لام ها به صورت متناوب حرارت دیدند و این عمل تا زمان ایجاد بخارات فنل بر سطح لام ها ادامه یافت. باید توجه داشت که در حین این عمل فوشین نباید بجوشد، زیرا کریستالیزه شده و به سطح لام می چسبد و کریستال آن به باسیل سل بسیار شبیه بوده و تشخیص این دو از یکدیگر بسیار دشوار است؛ لذا می تواند خطا در تشخیص ایجاد کند. پس از برداشتن حرارت و از زمان بلند شدن بخارات ۳ الی ۵ دقیقه زمان داده شد (شکل ۳-۵).

شکل ۳- ۵ مرحله ی اول رنگ آمیزی زیل نلسن- پوشاندن سطح لام با رنگ فوشین و حرارت دادن متناوب لام ها

۳-۵-۱-۲ مرحله ی رنگ بری-ساخت محلول رنگ بر
برای ساخت اسید الکل ۳% که به عنوان رنگ بر استفاده می شود، ۹۷ سی سی الکل ۹۶ درجه ی خالص با ۳ سی سی اسید کلریدریک خالص مخلوط شد. این نسبت باید همواره حفظ شود و باید توجه نمود که ظرف حاوی آن باید به گونه ای باشد که جلوی تبخیر الکل را بگیرد؛ زیرا در صورت تبخیر الکل غلظت اسید بالا رفته و خاصیت رنگبری اسید الکل بیشتر می شود. در نتیجه رنگی که به کمک حرارت به داخل باکتری نفوذ کرده بیرون خواهد آمد.
پس از اینکه فوشین با آب شسته شد، اسید الکل به عنوان عامل رنگبر اضافه گردید. ۱ تا ۳ دقیقه زمان برای رنگبری لازم است (شکل ۳-۶).

شکل ۳- ۶ مرحله ی دوم رنگ آمیزی زیل نلسن- رنگبری-پس از شسته شدن فوشین (۱)، اسید الکل اضافه (۲) و پس از گذشت ۱ الی ۳ دقیقه شسته شد(۳).

۳-۵-۱-۳ رنگ زمینه
رنگ زمینه در این رنگ آمیزی متیلن بلو ۳/۰ % می باشد که برای ساخت آن ۳ گرم پودر متیلن بلو در ۵۰۰ سی سی آب حل شد و پس از حل شدن آن ۵۰۰ سی سی آب مجدداً به محلول اضافه گردید.
متیلن بلو به عنوان رنگ زمینه در آخرین مرحله اضافه شد. تا ۶۰ ثانیه صبر کرده و پس از آن لام با آب شستشو داده شد. لام ها باید به آرامی شسته شوند و جریان آب نباید در حدی باشد که گسترش از روی لام کنده شود. سپس لام ها به صورت مورب در رک قرار داده شدند تا در مجاورت هوا خشک شوند (شکل ۳-۷).

شکل ۳- ۷ مرحله ی آخر رنگ آمیزی زیل نلسن- اضافه کردن رنگ زمینه (متیلن بلو)

۳-۶ بررسی و گزارش نتیجه ی لام
در آزمایش میکروسکوپی برای مشاهده ی باسیل اسید فست، نیاز به وجود حداقل ۱۰۰۰۰-۵۰۰۰ باسیل در هر میلی لیتر از نمونه می باشد. پس از انجام رنگ آمیزی ، ۱ تا ۲ قطره روغن ایمرسیون به سمت چپ اسمیر رنگ آمیزی شده افزوده و توسط میکروسکوپ دو چشمی و با استفاده از عدسی ×۱۰۰ مشاهده می شوند. این تکنیک ساده، سریع و ارزان است (شکل ۳-۸).

شکل ۳- ۸ نمونه ی لام رنگ آمیزی شده به روش زیل نلسن از نمونه ی مایع پلور بیمار، گسترش بالائی به صورت مستقیم و گسترش پائینی پس از هضم و آلودگی زدائی تهیه شده است.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منابع پایان نامه ارشد با موضوع نمونه برداری، تغییر رنگ

روش رنگ آمیزی زیل نلسن به وسیله ی IUATLD 34 پیشنهاد شده است و به دلیل حساسیت بالا معروف است. در زیر میکروسکوپ باسیل سل به رنگ صورتی تا قرمز، به شکل مستقیم و خمیده و همراه مقدار کمی گرانول و با آرایش جفت و یا گروهی در زمینه ی آبی دیده می شود (شکل ۳-۹).

شکل ۳- ۹ تصویر میکروسکوپی باسیل سل رنگ آمیزی شده با روش زیل نلسن در نمونه ی مایع پلور که با پیکان های قرمز رنگ مشخص شده اند.

تعداد باسیل های موجود در نمونه ی بیمار ارتباط مستقیم با درجه ی عفونت دارد. به همین دلیل نتیجه باید در یک الگوی کمی گزارش شود. روش ذکر شده در جدول ۳-۲ که توسط IUATLD پیشنهاد گردیده است، می تواند مورد استفاده قرار گیرد. تعداد باسیل اسید فست حداقل در ۱۰۰ میدان (تقریباً یک طول و یک عرض اسلاید) و با یک روش (از بالا به پائین یا از چپ به راست) شمارش می شود. به منظور گزارش باکتری به عنوان باسیل اسید فست به مورفولوژی و رنگ آن باید دقت شود. بررسی لامها باید به صورت مناسب و حداقل در ۱۰۰ میدان میکروسکوپی انجام گیرد (شکل ۳-۱۰).

شکل ۳- ۱۰ معادل سازی ابعاد گستره با تعداد میدان میکروسکوپی قابل بررسی-در صورتی که گسترش در ابعاد ۳×۲ باشد، خط افقی معادل ۱۵۰ میدان و خط عمودی معادل ۱۰۰ میدان خواهد بود.(۱ و ۲) در صورتی که اندازه ی گستره ۲×۱ باشد، خط افقی برابر ۱۰۰ میدان و خط عمودی برابر ۵۰ میدان در نظر گرفته میشود (۳ و ۴)

جدول ۳- ۲ روش خواندن اسمیرهای رنگ آمیزی شده توسط زیل نلسن (لنز ایمرسیون ×۱۰۰)
گزارش
تعداد باسیل اسید فست
منفی
بدون AFB در ۱۰۰ میدان ایمرسیون
تعداد باسیل مشاهده شده
۹-۱ عدد AFB در ۱۰۰ میدان ایمرسیون
+
۹۹-۱۰ عدد AFB در ۱۰۰ میدان ایمرسیون
++
۱۰-۱ عدد AFB در هر میدان
+++
بیش از ۱۰ عدد AFB در هر میدان

در همه ی متد های رنگ آمیزی، پاک کردن روغن از روی لنز پس از مشاهده ی لام اسید فست بسیار حائز اهمیت است، زیرا ممکن است باسیل اسید فست از سطح لام جدا شده و روی لنز بچسبد و برای نمونه های بعدی نتیجه ی مثبت کاذب ایجاد کند.
۳-۷ کشت
متداول ترین محیط کشت برای رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس محیط لوون اشتاین جنسن می باشد که در زیر به روش ساخت این محیط اشاره ای کوتاه می نمائیم.

۳-۷-۱ روش ساخت محیط کشت لوون اشتاین جنسن
محتویات محیط کشت لوون اشتاین جنسن شامل محلول نمکی، محلول مالاشیت گرین ۲ % و مخلوط یکنواخت تخم مرغ می باشد.

۳-۷-۱-۱ مخلوط یکنواخت تخم مرغ
تخم مرغ های تازه با استفاده از برس کاملاً تمیز شده و به مدت ۵-۱ دقیقه در محلول ۵ % صابون قرار می گیرند. سپس ظرف تخم مرغ ها زیر آب جاری و سرد قرار گرفته و پس از آن، به مدت ۱۵ دقیقه در الکل ۷۰% گذاشته می شوند. دستها با آب و صابون شسته شده و تخم مرغ ها در ظرف استریل شکسته می شوند. آنگاه توسط دستگاه تکان دهنده به خوبی مخلوط شده و قبل از اضافه شدن به محلول نمکی و مالاشیت گرین، از ۴ لایه پارچه ی نازک گذرانده می شوند (شکل ۳-۱۱).

شکل ۳- ۱۱ مراحل ساخت مخلوط یکنواخت تخم مرغ برای ساخت محیط کشت لوون اشتاین جنس
۳-۷-۱-۲ محلول نمکی
مقدار ۴/۲ گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، ۲۴/۰ گرم منیزیم سولفات، ۶/۰ گرم منیزیم سیترات، ۶/۳ گرم آسپارژین و ۱۲ میلی لیتر گلیسرول به ترتیب در ۶۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شدند و حرارت داده و سپس در دمای ۱۲۱ درجه ی سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه اتوکلاو شدند (شکل ۳-۱۲).

شکل ۳- ۱۲ مواد مورد استفاده جهت ساخت محلول نمکی

۳-۷-۱-۳ محلول مالاشیت گرین
برای ساخت این محلول ابتدا ۲ گرم رنگ مالاشیت گرین در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر استریل شده حل شد و سپس به مدت ۱ ساعت روی دستگاه قرار گرفت تا به خوبی حل گردد (شکل ۳-۱۳). بعد از آن رنگ در ظرف های درب دار مخصوص تقسیم و اتوکلاو شد. باید توجه داشت که مالاشیت گرین در معرض نور قرار نگیرد.

شکل ۳- ۱۳ محلول مالاشیت گرین- محلول توسط یک مگنت مغناطیسی هم زده می شود تا به خوبی مخلوط گردد.

پس از ساخت موارد فوق، ۶۰۰ میلی لیتر محلول نمکی، ۲۰ میلی لیتر محلول مالاشیت گرین و ۱۰۰۰ میلی لیتر محلول یکنواخت تخم مرغ با رعایت شرایط استریل داخل یک فلاسک ۲ لیتری ریخته شده و مخلوط گشتند. این مرحله نباید طولانی شود؛ چراکه کلسترول تخم مرغ مالاشیت گرین را جذب کرده و سبب روشن شدن رنگ محیط و خطا در تشخیص کلونی های نخودی رنگ می شود. سپس به مقدار ۶ تا ۸ میلی لیتر در لوله های درپیچ دار مک کارتنی ریخته و درب آنها به خوبی بسته شد (شکل ۳-۱۴).

شکل ۳- ۱۴ مراحل ساخت محیط لوون اشتاین جنسن- ۱. بر روی ارلن حاوی محلول نمکی و محلول مالاشیت گرین قیف استریل قرار داده می شود. ۲. محلول یکنواخت تخم مرغ اضافه می گردد. ۳. محتویات توسط دستگاه به خوبی مخلوط می گردد. ۴. محلول به دست آمده داخل فلاسک استریل ریخته می شود.۵. محیط های کشت ساخته شده وارد لوله های مک کارتنی می گردد.

۳-۷-۲ منعقد نمودن محیط
قبل از قرار دادن محیط ها ابتدای دمای دستگاه منعقد کننده ۳۵ را به ۸۰ درجه ی سانتی گراد رسانده و محیط ها به صورت مورب در دستگاه قرار داده شدند (شکل ۳-۱۵). محیط ها به مدت ۴۵ دقیقه در دمای ۸۰ تا ۸۵ درجه ی سانتی گراد منعقد می شوند. از آنجا

دیدگاهتان را بنویسید