No category

منابع پایان نامه ارشد با موضوع محدودیت ها، رگرسیون خطی، تحلیل داده، بهینه سازی

دانلود پایان نامه

استاندارد
µl 50 محلول استاندارد و µl 50 استرپتاویدین کونژوگه شده با HRP به این چاهک ها اضافه شد. لازم به ذکر است که آنتی بادی ضد اینترفرون گامای نشاندار شده با بیوتین از قبل در محلول های استاندارد اضافه شده است و لذا نیازی به افزودن مجدد ندارد.

۳-۱۰-۶-۳ چاهک های نمونه
به این چاهک ها µl 40 از نمونه و سپس µl 10 از آنتی بادی ضد اینترفرون گاما و µl 50 استرپتاویدین-HRP اضافه گردید. پس از آماده سازی چاهک ها به ترتیبی که در بالا ذکر شد، روی پلیت با پوشش مخصوص پوشانده شده و کاملاً تکان داده شدند تا مخلوط گردند و برای مدت ۶۰ دقیقه در c?37 انکوبه شدند.

۳-۱۰-۶-۴ تهیه ی محلول شستشو
محلول شستشوی موجود در کیت که شامل PBS، تواین ۲۰ و تایمرسال میباشد، باید با آب مقطر به مقدار ۳۰ برابر رقیق شود. به این منظور برای تهیه ی ۶۰ میلی لیتر از آن، در یک استوانه ی مدرج، ۵۸ میلی لیتر آب مقطر با ۲ میلی لیتر محلول شستشو مخلوط گشت.

۳-۱۰-۶-۵ شستشو
پس از انکوباسیون، پوشش روی پلیت به دقت برداشته و مایع خالی شد و با تکان های شدید باقی مانده ی مایع نیز خارج شده و رطوبت پلیت با ضربه بر روی کاغذ جاذب گرفته شد. هر چاهک با مقدار مناسبی از محلول شستشو پر شده و پس از گذشت ۳۰ ثانیه خالی شد. تکرار این عمل برای ۵ بار از دستورالعمل های کیت الالیزا بود.

۳-۱۰-۶-۶ ایجاد رنگ
ابتدا µl50 محلول کروموژن A و سپس µl 50 محلول کروموژن B به هر چاهک اضافه گردید. سپس به منظور مخلوط شدن به خوبی تکان داده شدند. پلیت به مدت ۱۰ دقیقه در c?37 به دور از نور انکوبه شد تا رنگ ایجاد گردد (شکل ۳-۲۴).

شکل ۳- ۲۴ تصویر سمت چپ تلقیح نمونه ها و اضافه کردن محلول های تست را در چاهک ها نشان می دهد. تصویر سمت راست قرائت توسط دستگاه خوانشگر الایزا که از نوع خوانشگر پلیت است را نمایان می سازد.

۳-۱۰-۶-۷ توقف واکنش
µl50 از محلول متوقف کننده ی واکنش که اسید سولفوریک می باشد به هر چاهک اضافه شد تا واکنش متوقف گردد. در این لحظه رنگ آبی فوراً به زرد تغییر یافت (شکل ۳-۲۴).

۳-۱۰-۷ فرایند اندازه گیری
چاهک بلانک به عنوان جذب صفر در نظر گرفته شد. جذب نوری برای هر چاهک یک به یک در طول موج nm450 توسط دستگاه خوانشگر الایزا اندازه گیری شد که این عمل باید تا ۱۰ دقیقه پس از اضافه کردن محلول متوقف کننده ی واکنش صورت پذیرد. رنگ زرد در طول موج nm450 بیشترین جذب را داراست. این در حالی است که در طول موج nm620 جذب نوری ندارد. برای اطمینان از صحت عملکرد دستگاه خوانشگر، طول موج nm620 نیز به دستگاه داده شد.
بر اساس غلظت استانداردها و مقدار جذب های نوری، معادله ی رگرسیون خطی برای منحنی استاندارد رسم شد. سپس بر اساس مقدار OD نمونه ها، غلظت نمونه های مربوطه اندازه گیری گردید. از نرم افزار SPSS ورژن ۲۰ برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده شد.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   پایان نامه دربارهروستاییان، عاشق و معشوق، شهر تهران

۳-۱۱ تعیین میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دی آمیناز
برای تعیین فعالیت این آنزیم که تصور می شود در موارد سل پلور فعالیت آن افزایش می یابد، از کیت تجاری -Adenosine Deaminase Assay Kit, Diazyme(r), USA, Catalog Number: DZ117A- استفاده شد. این کیت یکی از روش های Giusti بهینه سازی شده است که محدودیت های روش دستی که شامل نقص در استانداردسازی بود را رفع نموده است. نمونه های مایع پلور پس از سانتریفوژ به مدت ۱۵ دقیقه در دور ۳۵۰۰ و جمع آوری مایع روئی جهت بررسی فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز، در میکروپلیتهای دستگاه اتوآنالایزر در سینی مخصوص جای گرفتند.

۳-۱۱-۱ اجزای تشکیل دهنده ی کیت آدنوزین دآمیناز
کیت مذبور حاوی دو معرف می باشد که مقدار معرف یک ۵۰ میلی لیتر و معرف دو ۲۵ میلی لیتر است (شکل ۳-۲۵). معرف ۱ به رنگ قهوه ای روشن و به حالت مایع است و در دمای اتاق pH برابر ۷/۷ را داراست (جدول ۳-۶). اما معرف ۲ که بی رنگ و مایع است، در دمای اتاق pH برابر ۴ را نشان می دهد (جدول ۳-۷). کالیبراتور و کنترل ها به صورت جداگانه خریداری شدند. کالیبراتور و کنترل این کیت که به صورت لیوفیلیزه بودند، قبل از استفاده با mL 1/0 آب دیونیزه مخلوط شدند که پس از این عمل، آنها را می توان به مدت ۱ هفته در دمای ۸-۲ درجه ی سانتی گراد نگه داری نمود. معرف ها نیز می توانند تا پایان زمان مصرفشان در همین دما نگه داری شوند.
باید توجه داشت که از سیترات و یا اگزالات به عنوان ضد انعقاد نمونه ها استفاده نشود. معرف ها برای هر دو روش دستی و اتوماتیک آماده ی استفاده هستند.

شکل ۳- ۲۵ کیت تجاری Diazyme(r) جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز

جدول ۳- ۶ اجزای تشکیل دهنده ی معرف ۱ در Adenosine Deaminase Assay Kit, Diazyme(r)
مقدار
مواد
mM 50
Tris HCL, pH 8.0
mM 2
۴-آمینوآنتی پرین
mL/U 1/0
پورین نوکلئوزید فسفریلاز
mL/U 2/0
گزانتین اکسیداز
mL/U 6/0
پراکسیداز

نگهدارنده

دیدگاهتان را بنویسید