No category

منابع پایان نامه ارشد با موضوع نمونه برداری، تغییر رنگ

دانلود پایان نامه

هفته از زمان کشت در دمای ۳۷ درجه ی سانتیگراد

۱-۹ تشخیص سل پلور
بیماری که دارای علائم بالینی سل پلور مانند تب، تنگی نفس و درد قفسه ی سینه باشد و در فضای پلور تجمع مایع دیده شده و ترشحات جنبی حاوی تعداد لنفوسیت بالا باشد، مشکوک به سل پلور تلقی می گردد. نمونه برداری سوزنی از پرده ی جنب اغلب جهت تشخیص لازم است و در آن گرانولوم مشاهده می شود و یا تا ۸۰ درصد موارد کشت تهیه شده از آن مثبت می باشد. این شکل از سل جنبی به خوبی به درمان داروئی جواب می دهد و ممکن است به صورت خود بخود بهبود یابد. ممکن است مصرف همزمان گلوکوکورتیکوئید، طول مدت تب و یا درد قفسه ی سینه را کم کند، اما فایده ی آن ثابت نشده است. در صورتی که بیمار مبتلا به سل پلور درمان نشود، در طول ۳ سال آینده ممکن است به سل ریوی مبتلا گردد (Pickering, Sarefuji, Ahmed, Breen, & Milburn, 2013).

۱-۹-۱ سنجش اینترفرون گاما
اینترفرونها پروتئینهای طبیعی هستند که به وسیله سلولهای سیستم ایمنی مهره داران تولید می شود و مسئولیت آنها مبارزه با عوامل خارجی از قبیل ویروسها ، انگلها و تومورها می باشد. اینترفرونها به گروه بزرگی از گلیکوپروتئینها تعلق دارند که سایتوکین نام دارند. اینترفرونها بوسیله انواع گوناگونی از سلولها تولید می شوند که این سلولها به حضور RNA دو رشته ای واکنش نشان می دهند (کلید شناسایی آلودگی ویروسی) (Devlin, 2011). اینترفرون گاما سایتوکاین اصلی فعال کننده ماکروفاژهاست و اعمال مهمی را هم در ایمنی ذاتی و هم ایمنی اکتسابی انجام می دهد این سایتوکاین معرف زیر مجموعه TH1 (لنفوسیت T کمک کننده ) است. اینترفرون گاما را اینترفرون ایمن یا اینترفرون نوع II نیز می نامند. تا حدودی فعالیت غیر ویروسی دارد ولی از این لحاظ چندان قوی نیست و بیشتر به عنوان سایتوکاین اجرایی پاسخ ایمنی عمل می کند.
پلورزی سلی در نتیجه واکنش ازدیاد حساسیت تاخیری به آنتی ژن های مایکوباکتریال ایجاد می شود. تاثیرات سیتو توکسیک مایکوباکتریال ممکن است شکلی از این واکنش ها باشد. (Sester et al., 2011) در غالب بیماران بررسی میکروبیولوژیک مستقیم مایع پلور شامل پاسخ قطعی به عدم وجود عفونت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نیست، کشت مایع پلوربه چندین هفته زمان نیاز دارد و بیوپسی سوزنی پلور و توراکوسکوپی هر دو اقدامات تهاجمی محسوب می شوند.
در سالهای اخیر، مارکرهای بیولوژیک متعددی برای افزایش قدرت تشخیص پلورزی سلی به کار برده شده اند که اینترفرون گاما از آن جمله است(Cattamanchi et al., 2011). اینترفرون گاما یکی از مهمترین تنظیم کننده های سیستم ایمنی است که هم اثرات ضد ویروسی وهم اثرات سیوتوکسیک دارد. این لنفوکین همانطور که گفته شد توسط سلولهای ایمنی در پاسخ به تحریکات آنتی ژنیک وایمونولوژیک ساخته می شود. (Marie et al., 2013; Mazurek et al., 2010) تمام سلولهای T CD4+و سلولهای ۱ CD4+ Th ، می توانند اینترفرون گاما تولید کنند . اینترفرون گاما موجب افزایش فعالیت فاگوستیک ماکروفاژها علیه مایکوباکتریوم توبرکولوزیس شده و درسطح آن در جریان پلورزی سلی و در نتیجه افزایش تولید در موضع، افزایش می یابد (F. Liu et al., 2014; Titarenko et al., 2010). به دلیل اینکه لنفوسیت تولید کننده اینترفرون گاما به فضای پلور مهاجرت می کند و در نتیجه آن پاسخ سیستمیک به سلولهای فوق کاهش می یابد. (Dorhoi et al., 2011; Zwerling et al., 2011) مطالعات متعددی نشان داده اند که سطح اینترفرون گاما چه در ریزش جنبی و چه در سرم در جریان پلورزی سلی به طور چشمگیری نسبت به بدخیمی و سایر علل پلورزی افزایش می یابد و اینکه این افزایش در ریزش جنبی بسیار چشمگیر تر از سرم است. (Klimiuk & Krenke, 2011; Zwerling et al., 2011) به نظر می رسد که اندازه گیری این مارکر بیولوژیکی می تواند یک راه غیر تهاجمی تر و حساس تر در تشخیص پلورزی سلی باشد و بتوان از آن به عنوان جایگزین روشهای تهاجمی معمول سود برد (Aoe, Hiraki, & Murakami, 2004) که در این مطالعه نیز به بررسی ارزش تشخیصی تیتر آن در سل پلور پرداخته شده است. به منظور ارزیابی و اندازه گیری غلظت این سایتوکاین از روش ELISA بهره جستیم و بنابراین در ادامه ی این نوشتار به معرفی مختصری از این تکنیک و اجزای لازم برای آن می پردازیم.

۱-۹-۱-۱ تکنیک الایزا ۱۸
پایه ی اساسی آزمون الایزا براساس واکنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یک آنتی‌بادی اختصاصی با یک آنتی‌ژن مشخص واکنش داده و سپس با استفاده از یک آنتی‌بادی اتصال یافته با یک آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول که یک ماده رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد. طول موج رنگ بدست آمده که نشانگر حضور یک آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد (Devlin, 2011).

۱-۹-۱-۲ وسایل و تجهیزات مورد نیاز در روش الایزا
الف: کیت الایزا شامل:
۱- یک یا دو عدد پلیت ?? خانه‌ای که در ?? ستون هشت خانه‌ای قرار گرفته‌اند. هر یک ازخانه‌ها را چاهک۱۹ و هر ستون هشت خانه‌ای را یک استریپ۲۰ گویند. جنس چاهک‌ها از پلی‌ استیرن، پلی‌ وینیل کلراید و یا پلی‌ پروپیلن بوده، عمقی حدود ۱ سانتی متر داشته و به اشکال ته صاف و یا ته گود می‌باشند، که بطور ایده آل چاهک‌های ته صاف برای قرائت اسپکتروفتومتری در سنجش‌هایی که در آنها پیشرفت رنگ وجود دارد، پیشنهاد می‌شود.
۲- ویال‌های استاندارد، کنترل منفی و مثبت، که با توجه به نوع کیت می‌توانند بصورت محلول یا لیوفیلیزه باشند.
۳- رقیق‌کننده نمونه ۲۱ که مزیت آن اینست که با توجه به رقیق سازی نمونه، اثر هوک را تا حدود زیادی خنثی می‌نماید.
۴- کونژوگه نشاندار شده با آنزیم که از مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در الایزا می‌توان از پراکسیداز ترب کوهی یا HRP ، آلکالن فسفاتاز و پنی سیلیناز نام برد که عمدتا از پراکسیداز استفاده شده و از آلکالن فسفاتاز به علت گرانی، در کارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود. بایستی متذکر شد که آنزیم مورد استفاده برای نشاندارسازی، نقش مهمی در تعیین نوع سوبسترا و نیز نوع محلول متوقف‌کننده دارد.
۵- محلول شستشو که متشکل از بافر فسفات سالین ۲۲، تواین ?? و تایمرسال می‌باشد. باید توجه داشت که هر چند PBS با تنظیم قدرت یونی و pH مناسب، اتصال غیر اختصاصی به جدار چاهک را به حداقل می‌رساند؛ با این حال برای افزایش دقت و نیز کاهش اتصالات غیر اختصاصی، از مقدار کمی پروتئین ودترژان یعنی تواین ?? استفاده می‌شود. همچنین از آنجائی که محیط‌های بافری غالبا برای رشد میکروارگانیسم‌ها بسیار مناسب می‌باشند، لذا از ترکیبات نگهدارنده نظیر تایمرسال و سدیم آزید استفاده می‌شود؛ که البته با توجه به اینکه سدیم آزید مهار کننده آنزیم پراکسیداز می‌باشد، از این رو از تایمرسال استفاده می‌گردد.
۶- محلول سوبسترا- کروموژن که می‌تواند هم بصورت منفک از یکدیگر و یا بصورت ترکیبی باشد.
لازم بذکر است که در واکنش‌های آنزیمی، سوبسترا بر اساس حلالیت، می‌تواند محلول یا غیر محلول باشد؛ که در سنجش الایزا بایستی سوبسترا محلول باشد. زیرا اگر غیر محلول باشد، نمیتوان محصول را با دستگاه خوانشگر الایزا یا الایزا ریدر قرائت نمود و توضیحا اینکه، سوبسترای غیر محلول در روش دات الایزا ۲۳ و بلاتینگ کاربرد دارد. در مورد نوع سوبسترا نیز بایستی در نظر داشت، نوع سوبسترا بستگی به کونژوگه آنزیمی داشته و لذا اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، سوبسترا می‌تواند تترامتیل بنزیدین (TMB) و یا ارتوفنل دی آمین (OPD) بوده و رنگ حاصل از واکنش آنزیمی آبی خواهد شد. اما اگر کونژوگه آنزیمی ALP باشد، سوبسترا پارانیتروفنل (PNP) بوده و رنگ حاصل از واکنش نیز، زرد خواهد شد.
۷- محلول متوقف‌ کننده یا بلوکر۲۴ که با توجه به نوع کونژوگه آنزیمی، می‌تواند اسیدی یا قلیایی باشد. بدین ترتیب که اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، برای توقف واکنش بایستی از محلول‌های اسیدی نظیر اسید کلریدریک و یا اسید سولفوریک استفاده نمود. ولی اگر کونژوگه ALP باشد، بایستی از محلول‌های قلیایی نظیر NaOH استفاده کرد. لازم بذکر است که در اثر توقف واکنش توسط متوقف‌ کننده اسیدی، رنگ آبی تبدیل به زرد شده، در حالیکه تغییر رنگ حاصل از کاربرد متوقف‌ کننده قلیایی، بصورت تبدیل رنگ زرد به قهوه‌ای خواهد بود.
ب: دستگاه خوانشگر الایزا ۲۵ : دستگاه الایزا ریدر که در نهایی‌ترین مرحله آزمایش الایزا مورد استفاده قرار گرفته و جزء لاینفک تکنیک الایزا می‌باشد، در واقع شبیه اسپکتروفتومتر بوده، با این تفاوت که نوع کووت، مسیر خوانش و تعداد فیلترها تغییر نموده است. بدین ترتیب که بجای کووت، از چاهک استفاده شده و مسیر خوانش آن نیز بر خلاف تکنیک‌های فتومتری، بصورت عمودی می‌باشد. همچنین با توجه به اینکه در تکنیک الایزا از آنزیم‌ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می‌شود، از فیلترهای محدودی استفاده شده است (Thomas, 2011)

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   دانلود پایان نامه ارشد درموردسود سهام، تنزیل، ارزش سهام، سهامداران

۱-۹-۱-۳ روش الایزا ی ساندویچ ۲۶
در روش الایزای ساندویچی، مولکول اندازه گیری شده در واقع بین دو مولکول مختلف آنتی بادی قرار می گیرد (ساندویچ می شود). در فصل سوم مفصلاً در این باره جهت اندازه گیری اینترفرون گاما و اساس این روش بحث خواهد شد (شکل ۱-۱۲) (Devlin, 2011).

شکل ۱-۱۲ تصویری شماتیک از اساس تست الایزای ساندویچ- پروتئین هدف بین دو آنتی بادی حبس می شود.

۱-۹-۲ آنزیم آدنوزین دی آمیناز ۲۷
آدنوزین دآمیناز (ADA; EC 3.5.4.4) یکی از آنزیم های هیدرولاز است که با استفاده از یک مولکول آب باعث حذف آمونیاک از آدنوزین و دئوکسی آدنوزین شده و آنها را به ترتیب به اینوزین و دئوکسی اینوزین دآمینه می کند (شکل ۱-۱۳). ADA همچنین یک آنزیم ضروری برای مسیر کاتابولیکی نوکلئوتیدهای پورینی می باشد .

شکل ۱-۱۳ آنزیم آدنوزین دآمیناز که با استفاده از یک مولکول آب، آدنوزین را به اینوزین دآمینه می کند.

آدنوزین د آمیناز آنزیمی است که فعالیت آن در زمان عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس افزایش می یابد؛ دلیل این امر تحریک لنفوسیت های T توسط آنتی ژن های مایکوباکتری است (Kelam et al., 2013).

۱-۹-۲-۱ ویژگی های آدنوزین دآمیناز
آدنوزین دآمیناز در همه ی انواع سلول ها وجود دارد. اگرچه مقدار این آنزیم به طور گسترده ای میان بافت های مختلف بدن تفاوت دارد. بالاترین میزان ADA در انسان در بافت های لنفاوی یافت شده است. ADA در تکثیر و تمایز لنفوسیت ها به خصوص لنفوسیت های T نقش دارد. این آنزیم همچنین در بالغ شدن مونوسیت ها و تغییر شکل دادن

دیدگاهتان را بنویسید